两种新型抗血栓药物——水蛭素与水蛭肽

当今世界正步入老年社会, 仅我国50岁以上的人口就有3亿之多。血栓病是老年人的常见病,全世界有血栓栓塞性病人约1 500, 万所需溶栓剂的潜在市场约20亿美元。早期的抗(溶)血栓药物有纤维蛋白原溶解酶、尿激酶、链激酶等,但它们的临床应用有几个显著的缺点,如: 凝血酶会高比例再生等。而小的合成抑制因子如三肽d-Phe- Pro- Arg虽然具有高选择的抗凝血酶活性,但其半衰期仅有几分钟。水蛭素无论是皮下注射还是静脉注射都无明显的副作用,寿命约50min。水蛭肽做为第2代溶栓剂也受到日益广泛的关注。

1　水蛭素与水蛭肽

水蛭(学名)又名蚂蟥,是一种生长于沼泽、湖泊或水田中的环节动物,以吸食人畜的血液为生。水蛭是较强的活血化瘀药物,据《神农本草经》记载: “水蛭味咸平, 主逐恶血,月闭, 破血瘕集聚,无子, 利水道。”欧洲的John Haycraft博士在1884年发现欧洲医用水蛭会分泌出某种阻止血液凝结的物质以利于水蛭吸食血液消化。在20世纪初人们发现这种物质是一种蛋白质,并命名为水蛭素(Chirudin)。目前我们已经知道水蛭素并非是一种纯净物,而是一个具有同源结构的多肽化合物家族。这一家族中至少有3种分子,分别被命名为水蛭素-1、水蛭素-2、水蛭素-3,缩写为HV1、 HV2、 HV3。水蛭素可以与凝血酶(thrombin)按1∶1的比例以非共价的形式紧密结合成可逆复合物,从而阻止凝血酶催化的止血反应及凝血酶诱导的血小板激活反应,达到抗凝血的目的。水蛭肽( Hirulog)这一名称最初由J·M· Maraganore提出,是人们模仿水蛭素与凝血酶的相互作用机制,设计后通过化学合成或微生物发酵而得到的肽类凝血酶抑制剂。水蛭肽与水蛭素的抗凝血

作用使得它们在临床上可用于阻止静脉血栓和血管成形术后的血栓形成等,具有极高的医用价值。

2　水蛭素的性质、结构及其抗凝血机理

天然水蛭素是由65或66个氨基酸残基组成的单链多肽,分子量约为7000,能在极端的pH和热条件下稳定存在。水蛭素的形状类似蝌蚪,蝌蚪头部是多肽的N端,富含半胱氨酸(cys), 半胱氨酸间相互作用形成3个二硫键( Cys6- Cys14, Cys16- Cys28, Cys22- Cys39)。使N末端结构紧密; 蝌蚪尾部是含有多个酸性氨基酸和一个被磺酸化的酪氨酸( Tyr63)的多肽C末端。凝血酶(thrombin)是血液凝固和止血过程中的中心酶,它不但能剪切纤维蛋白原,将纤维蛋白原转化为纤维蛋白; 还能激活其它的凝固血液的酶类,如凝血因子Ⅴ、Ⅷ、ⅩⅢ和抗凝血酶蛋白C(Fenton,1981)等。凝血酶与大分子底物的相互作用取决于三个不同的区域:催化反应位点的初级结合位点C(Magnusen, 1971),邻近催化位点的非极性结合位点AB(Brlinrand Shen, 1977; Sonder and Fenton, 1984)和负责凝血酶与纤维蛋白原专一性作用的阴离子结合位点(识别位点)   R(Fenton et al. 1989; Henriksenand Mann, 1988)。水蛭素的N端能封阻凝血酶的活性位点,其疏水结构域与凝血酶的非极性结合位点( AB)互补,该非极性结合位点靠近凝血酶的催化中心。水蛭素C末端有6个酸性氨基酸, 能与带正电的凝血酶识别位点形成许多离子键。N端、C端两个功能域以协同的方式结合到凝血酶上, 在凝血酶的活性部位形成一个帽子,阻止底物的结合。为了更好地了解水蛭素结构对性能的影响,人们对于水蛭素的N端、C端和各位点做了大量研究,得出许多结论,为水蛭肽的设计打了坚实的理论基础。各种研究表明水蛭素C末端的10个氨基酸是必需的最小结构, C末端的最佳大小至少是12个氨基酸( Hir54- 65),在这一序列中每个氨基酸都非常重要。几个疏水残基和酸性残基对于维持水蛭素C末端的功能非常重要。

3　水蛭肽的结构与功能

水蛭肽(hirulog)是以水蛭素为模板设计出的肽类凝血酶抑制剂,其氨基酸数目与顺序也因设计者的不同而不同。最初的水蛭肽是由Maraganore等设计的, 具有20个氨基酸残基, 含有2个结构域(domain)和一个连结区。其中C端是由水蛭素羧基末端衍化来的,能与凝血酶的催化反应位点紧密结合。在水蛭肽的设计中,现在公认应由三部分组成: 水蛭素羧端10肽、凝血酶催化活性位点的特异识别序列和二者间的功能连接桥。

水蛭肽通过(d- Phe)- Pro- Arg-Pro序列直接与凝血酶活性部位结合,如果用1- Phe取代N端的d- Phe,水蛭肽的抗凝血酶活性将大幅度地降低;当将(d- Phe)- Pro- Arg- Pro序列全部去除时, 在浓度不高于10μm时将测不到对凝血酶的抑制性。水蛭肽对凝血酶的作用机理不完全同于水蛭素,其半寿期也会有所不同。此外, 体外实验还显示水蛭肽对与纤维蛋白(血凝块)结合的凝血酶的抑制作用比水蛭素强。

4　临床效果

国内外学者通过动物模型和志愿者试验,对水蛭素(肽)的药理特性进行了大量的研究。俄罗斯科学家通过对57名患不同疾病(冠心病、风湿病、慢性肺病)的病人进行试验,确认水蛭素对防止血凝是有效的, Markwardt等的研究也显示了水蛭素对人具有良好的抗血栓作用。水蛭肽在动物实验中也显示了良好的抗凝和抗血栓作用。进入20世纪90年代后,人们将水蛭肽在接受心血管术的冠心病患者、不稳定性心绞痛患者和冠脉成型术中进行了临床试验, 均取得了较理想的效果。

与现在应用最广泛的抗凝血酶药物——肝素相比,水蛭素与水蛭肽具有以下优点: 第一,水蛭素与水蛭肽抑制凝血酶的反应不需要抗凝血酶Ⅲ( AT—Ⅲ)作为辅助因子, 使其抗凝作用与量效关系更吻合而且可在缺乏抗凝血酶Ⅲ的病人(如弥漫性血管内凝血)中使用;

第二,肝素不能灭活结合于血栓上的凝血酶,而水蛭素与水蛭肽则对循环中的和结合于血栓上的凝血酶都可以抑制; 第三,肝素会被激活的血小板释放的血小板因子4(PTF4)或富含组氨酸的糖蛋白等结合,而水蛭素与水蛭肽则不受这些因素的影响; 第四,水蛭素与水蛭肽用于抗血栓治疗,出血副作用较小,且无过敏反应和免疫原性,无毒反应。天然水蛭素的医用价值早已受到普遍重视,但由于天然材料来源

的限制,人们将注意力转向用基因工程手段生产的重组水蛭素及其多肽,成功采用的表达系统有大肠杆菌、酵母、昆虫细胞以及哺乳动物细胞等,并研究了纯化程序及其临床应用。目前,世界上许多公司正努力将重组水蛭素及水蛭肽用于开发新药,意大利、法国、德国、瑞士、美国等均有公司在进行研究,并且已有公司在中国申请专利, 我国也有几个单位正在开展这方面的研究。重组水蛭素与水蛭肽正式用于临床后,将会逐步取代肝素的主导抗栓剂地位。